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慢性應激對2型糖尿病大鼠HPA 軸紊亂及海馬損傷的影響(一)

中華中醫藥學刊

慢性應激對2 型糖尿病大鼠HPA 軸紊亂及海馬損傷的影響

楊蕙1,王宇紅2,張秀麗2,尹玲桃1,孟盼2

( 1. 湖南中醫藥大學**附屬醫院,湖南長沙410007; 2. 湖南省中藥粉體與****省部共建國家重點實驗室培育基地,湖南長沙410007)

摘要: 目的: 探討慢性應激對2 型糖尿病大鼠HPA 軸紊亂及海馬損傷的影響。方法: 采用高脂灌胃聯合尾

靜脈注射鏈脲佐菌素( STZ) 的方法制備2 型糖尿病動物模型并隨機分為兩組: 一組給予慢性應激3 周,另一組不進行慢性應激; 同時以空白對照組及慢性應激組為對照。造模結束后,Morris 水迷宮測定動物空間學習記憶能力; ELISA 法測定血漿皮質酮( CORT) 、促腎上腺皮質**( ACTH) 、促腎上腺皮質**釋放**( CRH) 水平; HE染色觀察海馬、下丘腦、垂體和腎上腺形態學變化。結果: 與正常組比較,糖尿病組、慢性應激組及糖尿病聯合慢性應激組大鼠水迷宮實驗逃避潛伏期( EL) 延長,空間探索時間( SET) 縮短; 血漿CORT、ACTH、CRH 水平升高; 海馬、下丘腦、垂體和腎上腺形態結構呈現不同程度的器質性改變; 但是糖尿病聯合慢性應激組大鼠各項指標變化程度具有顯著性意義( P 0. 05) 。結論: 慢性應激可導致糖尿病大鼠HPA 軸紊亂及海馬損傷,大鼠學習記憶能力受損可能與此有關。

關鍵詞: 2 型糖尿病; 慢性應激; HPA ; 海馬

中圖分類號: 332 文獻標志碼: A 文章編號: 1673-7717( 2014) 11-2660-04

 

糖尿病是一種體內胰島素分泌優良或相對不足,導致血糖過高,出現糖尿,進而引起脂肪和蛋白質代謝紊亂的**。2010 年世界衛生組織調查顯示,全世界約2.85 億糖尿病( diabetes mellitus,DM) 病人,比2007 年增加1.56 億,2030 年預計可達4. 39 億[1]。糖尿病已成為繼心腦血管病、癌癥之后的第三大殺手。糖尿病的病因及發病機理較為復雜,至今尚未完全闡明[2]。近年來,在生物 心理-社會新的醫學模式下,糖尿病被認為是與心理因素密切相關的心身**,但對心理應激在糖尿病的發生、發展、轉歸中所起的作用還沒有達到統一的認識。隨著應激對糖尿病影響研究的逐步深入,精神因素和應激事件對糖尿病的影響也越來越為人們所重視[3]。研究表明,外界應激主要通過影響機體***紊亂而加重糖尿病的病情。由于應激可影響機體的**神經系統,如海馬[4],而**神經系統對***,尤其是HPA 軸具有調控作用[5],因此推測,慢性應激可通過影響機體海馬結構與功能,致***紊亂,HPA軸亢進,進一步影響糖尿病的病程。本實驗通過給予2 型糖尿病大鼠慢性溫和不可預知性應激,探討糖尿病大鼠學習記憶能力,HPA 軸***指標及重要臟器的病理改變,為現代社會糖尿病的發**展提供新的研究思路。

1 實驗材料與方法

1. 1 藥品與試劑

鏈脲佐菌素( STZ) 由索萊寶公司提供; 高脂乳劑組成:10% 膽固醇、0. 2% 丙硫氧嘧啶、20% 豬油、2% 膽酸鈉、20%吐溫 80、20%丙二醇、加蒸餾水至100 mL 配制而成。CORT、ACTH、CRH 試劑盒由D 提供。

1. 2 實驗儀器

DB001Morris 水迷宮,北京智鼠多寶生物科技有限責任公司; MK3 型酶標儀,Thermo,美國; ET - 12P 組織脫水機,江西富華生物技術有限公司; M223 切片機,德國萊卡;DVP -W7 顯微鏡圖像處理系統,南京長城信息系統公司。

1. 3 動物模型的建立及分組

SPF 級雄性SD 大鼠50 只, 180 ~ 200 g,由湖南斯萊克景達實驗動物有限公司提供,許可證號: SCXK( 湘) 2009 -0004; 合格證號: HNASLKJ20102728。除空白組及慢性應激組以外,其余大鼠均以高脂乳劑10 mL/kg 連續灌胃14 d,每天1 次。末次灌胃高脂乳劑后,大鼠禁食不禁水24 h,一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素( STZ,溶于新鮮配制的0. 1mol /L,pH = 4. 5 枸櫞酸緩沖液中,4 ℃保存) 38 mg /kg,正常對照組1 次性尾靜脈注射0. 1 mol /L,pH = 4. 5 枸櫞酸緩沖液,注射體積為2 mL/kg。造模72 h 后,所有大鼠禁食不禁水7 h,測定空腹血糖,從中選取空腹血糖≥16. 00 mmol /L 的大鼠為2 型糖尿病模型。糖尿病模型大鼠隨機分為2組,分別為糖尿病組,糖尿病加21 d 慢性應激組,以正常組和慢性應激組為對照,每組8 只。慢性應激包括4 ℃冰水浴5 min, 45 ℃熱刺激5 min,傾籠45° 24 h,噪音8 h,晝夜

顛倒24 h,潮濕墊料( 200 mL/籠, 24 h) ,夾尾1 min。每天采用一種刺激,同種刺激不連續出現。造模結束后進行Morris 水迷宮實驗,實驗結束后取血測定血漿皮質酮( CORT) 、促腎上腺皮質**( ACTH) 、促腎上腺皮質**釋放**( CRH) 水平,HE 染色觀察海馬、下丘腦、垂體和腎上腺形態學變化。

1. 4 指標測定

1. 4. 1 Morris 水迷宮Morris 水迷宮被均分為A、B、C、D 4個象限。訓練前,水迷宮內盛自來水,加墨汁使水變漆黑,檢測前將平臺置于D 象限水面下2 cm,使其在實驗光線下對大鼠不可見。所有實驗均在9 ∶ 00 - 15 ∶ 00 之間進行,且保持室內安靜,物品放置及燈光狀態一致,水溫( 24 ± 1)℃。第1 ~ 4 d 定位航行實驗: 按逆時針方向分別從A、B、C、D 4 個象限將大鼠面向池壁放入水中,觀察并計時60 s,檢測前將平臺置于D 象限正中水面下2 cm。攝像系統記錄大鼠尋找并爬上平臺的時間為逃避潛伏期( evasive latency,EL) ,若60 s 內還未找到平臺,則引導其至平臺,停留15s,逃避潛伏期記為60 s。實驗結束后以4 d 的逃避潛伏期曲線反映大鼠的學習能力。第5 d 空間探索實驗: 撤除平臺,將大鼠從距原平臺*遠的B 象限面向池壁放入水中,攝像系統記錄大鼠在60 s 內各象限游泳時間,以在原平臺所在D 象限游泳時間即空間探索時間( space explorationtime,SET) 作為記憶成績。

1. 4. 2 血漿指標測定10% 水合氯醛3 mL/kg 腹腔麻醉下行腹主動脈取血, 2500 r /min 離心15 min 取血漿保存于 80℃ 冰箱,嚴格按照ELISA 試劑盒說明書測定血漿CORT、ACTH、CRH 含量。

1. 4. 3 組織病理學檢測大鼠取血后,摘取大腦,垂體,腎上腺,立刻經4% 福爾馬林固定,常規脫水,石蠟包埋,切片,HE 染色,光學顯微鏡下進行組織形態學觀察。

1. 5 統計學處理

采用SPSS 11. 0 進行統計學分析。多組間比較用方差分析,每組兩兩比較用q 檢驗,數據以珋x ± s 表示。

2 實驗結果

2. 1 Morris 水迷宮實驗定位航行實驗中,與正常組比較,糖尿病組、慢性應激組和糖尿病聯合慢性應激組大鼠的逃避潛伏期均隨著訓練時間的延長而有不同程度的延長( P 0. 05) ; 當實驗進行到第4 d,糖尿病聯合慢性應激組大鼠較糖尿病組和慢性應激組的逃避潛伏期顯著延長( P 0. 05) ,即學習能力*差??臻g探索實驗中,與正常組比較,糖尿病組、慢性應激組和糖尿病并發抑郁癥組的探索時間均有不同程度的縮短,其中慢性應激組和糖尿病并發抑郁癥組時間縮短具有統計學意義( P 0. 05) 。結果表明,慢性應激或糖尿病均可在一定程度上導致大鼠學習記憶能力受損,但糖尿病聯合慢性應激后,大鼠學習和記憶能力衰退*為明顯,結果見表1。

 


 

2. 2 血漿CORT、ACTH、CRH 含量測定與正常對照組比較,糖尿病和慢性應激大鼠血漿CORT、ACTH、CRH 水平均顯著升高( P 0. 05) 。與糖尿病組和慢性應激組比較,糖尿病聯合慢性應激組大鼠血漿

CORT、ACTH 水平顯著升高( P 0. 05) ,CRH 水平僅稍有升高( P 0. 05) 。結果表明糖尿病大鼠體內存在HPA 軸亢進,**分泌紊亂的現象,慢性應激會進一步惡化HPA軸紊亂,結果見表2。

 

 


2. 3 大鼠海馬,下丘腦,垂體,腎上腺病理檢測

2. 3. 1 大鼠海馬形態學變化正常大鼠海馬椎體細胞正常排列,形態正常。糖尿病組、慢性應激組和糖尿病聯合慢性應激組大鼠椎體細胞均可見不同程度的胞體固縮,深染及空泡變性,表明海馬細胞存在一定程度的損傷。其中糖尿病聯合慢性應激組病變*為明顯,結果見插頁Ⅶ圖1。

2. 3. 2 大鼠下丘腦形態學變化正常對照組大鼠下丘腦細胞分布均勻,細胞呈圓形,核/質比例等形態正常。糖尿病組、慢性應激組和糖尿病聯合慢性應激組大鼠神經元胞體增大,部分出現空泡樣變性,提示下丘腦分泌處于亢進狀態。其中糖尿病組與糖尿病聯合慢性應激組病變程度相似,均大于慢性應激組,結果見插頁Ⅶ圖2。

2. 3. 3 大鼠垂體形態學變化正常對照組大鼠垂體嗜酸性細胞和嗜堿性細胞分布均勻,分泌ACTH 的嗜堿性細胞分布均勻,形態正常。糖尿病組、慢性應激組和糖尿病聯合慢性應激組大鼠垂體均出現不同程度的嗜堿性細胞數量增多,細胞體積增加,細胞核深染,竇狀****增多,提示腺垂體分泌處于亢進狀態。其中糖尿病聯合慢性應激組病變程度*為嚴重,結果見插頁Ⅶ圖3。

2. 3. 4 大鼠腎上腺形態學變化正常對照組大鼠腎上腺球狀帶和束狀帶分界清晰,分泌糖皮質**的束狀帶細胞排列整齊。糖尿病組、慢性應激組和糖尿病聯合慢性應激組大鼠腎上腺球狀帶和束狀帶分界模糊,束狀帶細胞數量增多,體積增大,胞漿空泡增多,提示腎上腺分泌處于亢進狀態。其中糖尿病聯合慢性應激組束狀帶細胞病變*為嚴重,結果見插頁Ⅶ圖4。


 

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