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水迷宮---慢性皮質酮注射誘導焦慮性抑郁樹鼩模型的研究(一)


網絡出版時間: 2017  12  14 13: 50    網絡出版地址: http: / / kns cnki net / kcms / detail /34 1086  20171211 1848 058 html

◇實驗方法學◇

慢性皮質酮注射誘導焦慮性抑郁樹鼩模型的研究(一)
吳夢瑤,趙洪慶,楊 琴,柳 卓,杜 青,孟 盼,韓遠山,王宇紅



( 湖南中醫藥大學,湖南省中藥粉體與**藥W省部共建國家重點實驗室培育基地,湖南 長沙 410208)

doi: 10. 3969 / j. issn. 1001 - 1978. 2018. 01. 029

文獻標志碼: A 文章編號: 1001  1978( 2018) 01  0141  05

中國圖書分類號: -332; 322. 81; 347; 363-332; 749. 41;

749. 72; R977. 11

摘要: 目 探討慢性皮質酮注射對近靈長類動物樹鼩焦慮和抑郁樣行為的影響,并進行藥W預見性評價,建立新型   慮性抑郁動物模型。

方法 12 只中緬樹鼩隨機分為正常組、模型組和文拉法辛組,每組 4 只。采用慢性皮質酮注射( ih,27 mg·kg  1 ,21 d) 建立焦慮性抑郁樹鼩模型,文拉法辛組于造模同時灌胃給藥( 6 mg·kg  1 ) 。采用自主活動評分、糖水偏好測試、Morris  水迷宮實驗評價樹鼩的焦慮和抑郁行為表現; ELISA 試劑盒檢測樹鼩血漿 CRH、ACTH、COR 含量; HPLC-ECD  法檢測樹鼩腦內海馬、杏仁核、前額葉皮質的單胺遞質 5-HT、NE、DA  含量。

結果與正常組比較,模型組樹鼩自主活動評分、糖水偏食度、學習記憶能力均明顯下  降( P  0. 01 ) ,血漿 CRH、ACTH、COR 含量明顯上升( P 0. 05) ,海馬、杏仁核、前額葉皮質 5-HT、NE、DA 含量降低( P 0. 05 ) ; 文拉法辛組樹鼩學習記憶能力得到改善,血漿CRH、CO 含量明顯降低( P  0. 05) ,各腦區 5-HT、NE、DA 含量上升( P  0. 05) 。結論 焦慮性抑郁模型樹鼩具有明顯的 HPA 軸亢進及單胺遞質失調現象,而文拉法辛能夠逆轉該現象,說明該焦慮性抑郁樹鼩模型具有藥W預見性, 一種更接近人類臨床的新型焦慮性抑郁動物模型。

 

關鍵詞: 焦慮; 抑郁; 樹鼩; 文拉法辛; HPA 軸; 單胺遞質; 皮質酮

 

焦慮性抑郁癥是一種重性抑郁與焦慮共病的復合型精 神障礙J病,具有精神運動遲滯、致殘率及自S率高、社會功 能損害重、預后差等特征1]。大量研究表明,焦慮與抑郁的 發病機制均涉及到神經遞質失調2]、下丘腦 垂體 腎上腺( hypothalamic- pituitary- adrena,HPA) 軸紊亂、神經營養缺乏等3,然而,焦慮性抑郁J病的發病機制研究進展緩慢。本課題組前期已建立焦慮性抑郁大鼠模型4,但考慮到該復合型J病的特殊性以及嚙齒類動物與人類親緣關系的疏遠性, 采用常規的嚙齒類動物并不能完全滿足該J病的研究,建立一種更能模擬焦慮性抑郁臨床發病特點的合適模型對該病的防治尤為重要5]。

因此,本實驗擬采用近靈長類動物樹鼩6] 為研究對象, 通過慢性皮質酮注射建立焦慮性抑郁樹鼩模型,研究焦慮性抑郁模型樹鼩血漿促腎上腺皮質J素釋放J素( corticotropin releasing hormone,CH) 、皮質醇( cortisol,CO、促腎上腺皮質J素( adrenocorticotrophic hormone,ACTH ) 及海馬、杏仁核、前額葉皮質的單胺遞質 5-羥色胺( 5-hydroxytryptamine,5- HT) 、去甲腎上腺素( norepinephrine,NE) 、多巴胺( dopamine, DA) 含量的表達情況,并采用臨床**該J病的一線用藥文拉法辛對模型樹鼩進行干預,進行藥W預見性研究,確定模型的可行性,為該病的臨床防治及抗焦慮性抑郁新藥的研發提供有力的實驗基礎。

1 材料與方法

1 1    動物    CL 級中緬樹鼩 12 只,,體質量 130  150 g,購自云南昆明樹鼩種質資源中心,飼養于湖南中醫藥大學**附屬醫院 SPF 級實驗動物中心SYXK( 湘) 2015-0003。飼養于不銹鋼籠具內,室溫( 24 ± 2) ℃ 、相對濕度( 50 ± 5) % 、光/ 暗周期 12 h /12 h,按實驗動物 3 原則給予人道關懷。

1. 2    試劑與儀器     CRH、ACTH、CORT 試劑盒( 美國 R&D公司) ; 文拉法辛緩釋片( 成都康弘藥業) ; 皮質酮( 北京索萊寶生物公司) ; 5-HT、NE、DA 對照品( 中國藥品生物制品檢定所) 。Morris 水迷宮( 北京智鼠多寶生物科技公司) ; 動物行為學習記憶系統( 法國 Viewpoint 公司) ; MK-3 型酶標儀( 美國 Thermo Scientific 公司) ; 全自動勻漿機( 德國 IKA 公司) ; 1260 型高效液相色譜儀( 美國安捷倫公司) ; SDC 電化學檢測器( 荷蘭 Antec 公司) 。

1 3    造模及分組    12 只樹鼩隨機分為 3 組: 正常組、模型組、文拉法辛組,每組 4 只。正常組樹鼩正常飼養; 根據文獻報道的樹鼩對大鼠體表換算系數7,模型組樹鼩每天給予皮質酮皮下注射( 27 mg·kg 1 ) ,持續 21 d; 文拉法辛組樹鼩于造模同時灌胃給予藥W文拉法辛( 6 mg·kg  1 ,1 d) ,正常組和模型組給予等體積生理鹽水,造模完成后,進行行為學測試。   試完成后,將動物麻醉,腹主動脈取血,于冷凍臺上分離出大   腦海馬、杏仁核、前額葉皮質、丘腦等組織,液氮中保存備用。

1 4    行為學檢測

1 4 1    自主活動評分    造模結束后,分析樹鼩的自主活動能力,時間為 5 min。自主活動評分包括移動( 水平方向的位移) 和跳躍( 垂直方向的位移) ,將兩者次數相加表示各組樹鼩的相對活動能力。

1 4 2    糖水偏好測試    各組樹鼩禁水 12  h 后,每籠放置 2個水盒,一個裝 100 mL 蔗糖水( 0. 029 mol·L  1 ) ,另一個裝等量的蒸餾水,測定樹鼩在 6 h( 9 ∶ 00  15 ∶ 00) 內分別攝入蔗糖水和蒸餾水的體積,并計算糖水偏好率( 糖水消耗體積/ 總消耗體積 × 100% ) 。

1 4 3    Morris 水迷宮實驗    水槽平均劃分為 A、B、C、D 4 個象限,用奶粉將水調成乳白色,將平臺置于水面下 2  cm,使其在實驗光線下對樹鼩不可見。于實驗 d 17 開始對樹鼩進行適應性訓練,即從平臺象限的正對面將樹鼩面向池壁放入   水中, 75 s 內未找到平臺,則將其牽引至平臺處停留 10 s, 每天訓練 1 次,持續4 d8]。每次訓練結束后,迅速用毛巾將樹鼩毛發擦干,以防止樹鼩低體溫。

定位航行實驗: 訓練完成后,將樹鼩從訓練位置面向池壁放入水中,觀察并記錄樹鼩爬上平臺所需時間,即逃避潛伏期( escape latency,EL) ,考察其學習能力。

探索實驗: 于實驗 d 21 撤除平臺,由同一入水點將樹鼩面向池壁放入水中,記錄 1 min 內樹鼩在平臺所在象限的停留時間( stay time,ST) ,考察其記憶能力。

1 5    HPA 軸指標含量測定    行為學測試完成后,用****鈉( 40 mg·kg 1 ) 將動物麻醉,腹主動脈取血,收集于肝素鈉管中,3 000 r·min  1 離心 15 min,取血漿, 80℃ 保存。格按照 ELISA 試劑盒說明書檢測各組樹鼩血漿 CRH、ACTH、COR 的含量。

1. 6    單胺遞質含量測定

1. 6 1    腦組織勻漿樣本制備    取冷凍保存的海馬、杏仁核、前額葉皮質,精密稱重, 1 ∶ 3 比例( 杏仁核為 1 ∶ 10) 分別

加入 0. 01 mol·L 1 高氯酸溶液( 內含 0. 03 mmol·L 1 ED-TA,10 μg·L  1 內標 DHBA) ,于冰上進行勻漿,勻漿后 4℃ 、13 000 r·min 1 離心 10 min ,取上清, 0. 22 μm 針頭過濾器過濾后進樣。

1 6 2    色譜條件      色譜柱: Quattro 3  C18 柱( 150  mm × 2. 1

mm,3 μm) ; 流動相: 90 mmol·L  1 單水磷酸二氫鈉、50 mmol·L  1 單水檸檬酸、1. 7 mmol· L  1 辛烷磺酸鈉、50 mol

·L 1 EDTA 的混合液 甲醇( 87 ∶ 13 ) ; 流速: 0. 2 mL · min 1 ; 柱溫: 35℃ ; 進樣量: 20 μL。

1 6 3    標準曲線繪制    精密稱取適量 5-HT、NE、DA 對照品,溶于0. 01 mol·L 1 高氯酸溶液中,配成 1 g·L 1 混合儲備液。取適量體積的儲備液稀釋成 5  個梯度濃度點,從低到高依次為

3. 125、6. 25、12. 5、25、50 μg·L 1 ,將標準品溶液由低濃度至高濃度進樣,進樣體積20 μL,對色譜峰進行積分,記錄峰面積。以濃度為橫坐標,峰面積為縱坐標繪制標準曲線( Fig 1) 。

7   統計學分析   采用 SPSS 17.  0 軟件進行統計分析,驗數據以 x± s 表示。組間差異比較采用單因素方差分析, 兩兩比較方差齊時采用 LSD 檢驗法,方差不齊時采用 Dun- netts T3 法進行分析。



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