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水迷宮-復方柴金解郁片對慢性應激抑郁大鼠HPA軸及海馬單胺神經遞質的影響

本文引用:韓遠山,藺曉源,易剛強,王宇紅, , ,趙洪慶, .復方柴金解郁片對慢性應激抑郁大鼠 HPA 軸及海馬單胺神經遞質的影響[J].湖南中醫藥大學學報,2017,37(3):240-244.

 

復方柴金解郁片對慢性應激抑郁大鼠HPA 軸及海馬單胺神經遞質的影響

 

韓遠山 1,藺曉源 1,易剛強 2*,王宇紅 2,楊 1,孟 2,趙洪慶 2,杜 2

(1.湖南中醫藥大學**附屬醫院,湖南 長沙 410007;2.湖南中醫藥大學,湖南省中藥粉體與****省部共建國家重點實驗室培育基地,湖南 長沙 410208)

 

〔摘要 目的 研究復方柴金解郁片對慢性應激抑郁模型大鼠 HPA 軸及海馬單胺神經遞質的影響,探討其可能的抗抑郁機制。 方法 SD 大鼠隨機分為 6 組:對照組、模型組、氟西汀組(5.4 mg/kg)、復方柴金解郁片高、中、低劑量組(2.74、1.37、

0.68 g/kg),采用慢性不可預見性溫和應激建立抑郁模型,于造模同時給藥,連續 28 d。采用蔗糖偏好實驗和曠場測試檢測大鼠的抑郁樣行為,Morris 水迷宮檢測大鼠的學習記憶能力,HE 染色觀察大鼠海馬病理結果變化,ELISA 法檢測大鼠血漿促腎上腺皮質**釋放**(CRH)、促腎上腺皮質**(ACTH)、皮質酮(CORT),以及海馬 5-羥色胺(5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5- HIAA)、去甲腎上腺素(NA)、多巴胺(DA)的含量。 結果 與抑郁模型組比較,復方柴金解郁片組大鼠蔗糖偏嗜度及活動次數均顯著提高,學習記憶能力提升,海馬病理損傷情況得到緩解,血漿 CRH、ACTH、CORT 含量下降,海馬組織內 5-HT、NA、DA 含量上升,5-HIAA 含量下降(P<0.05)。  結論   復方柴金解郁片能顯著改善模型大鼠情緒和學習記憶功能、緩解海馬組織損傷,其作用可能與抑制 HPA 軸亢進、增加腦內單胺遞質含量有關。

〔關鍵詞 復方柴金解郁片;抑郁;慢性應激;HPA 軸;海馬;單胺遞質

〔中圖分類號〕R285.5 〔文獻標識碼〕A 〔文章編號〕doi:10.3969/j.issn.1674-070X.2017.03.003


抑郁癥是以情緒低落、興趣喪失、思維遲緩為主要特征的精神性**,具有高發病、高復發、高**、高醫療成本的特點。 現代醫學研究認為,下丘腦-垂體-腎上腺軸(HPA 軸)是機體一個重要的***軸,海馬是 HPA 軸負反饋的調節**,同時也是學習、 記憶以及引起情感障礙的關鍵腦區,HPA 軸失調依賴性的海馬神經元損傷是抑郁產生的主 要驅動力[1-2]。 復方柴金解郁片(磚利授權號為 ZL20 1210126887.X)具有“疏肝**、**解郁”之功效, 臨床用于**輕、中度抑郁癥,療效顯著。 為了能更好地探明復方柴金解郁片的抗抑郁功效及其機制, 本研究以慢性不可預見性應激抑郁模型大鼠為研究 對象, 通過研究復方柴金解郁片對模型大鼠行為、HPA 軸指標促腎上腺皮質**釋放**(CRH)、促腎上腺皮質**(ACTH)、皮質酮(CORT)以及海馬單胺遞質 5-羥色胺(5-HT)、5-羥吲哚乙酸(5-HIAA)、去甲腎上腺素(NA)、多巴胺(DA)的調控作用,探討其抗抑郁作用的機制。

1 材料與方法

1.1 動物

SPF 級雄性 SD 大鼠 75 只,體質量 160~180 g, 由北京維通利華實驗動物有限公司提供, 合格證號:No.11400700028228。許可證號:SCXK(湘) 2012-

0001。 在光/暗周期為 12 h/12 h (光照時間 7:00~

19:00)的條件下飼養于籠中,自由飲水和攝食。

1.2 **

復方柴金解郁片浸膏粉,相當生藥量為 6.6 g 生藥/g(文中均按生藥量計算)(由湖南中醫藥大學**附屬醫院藥劑科提供,批號為 20121025)。 復方柴金解郁片臨床擬用**每日生藥量為 20.5 g。 鹽酸氟西汀分散片,Patheon France 生產,批號 2860A。

1.3 試劑與主要儀器

    5 -HT、5 -HIAA、NA、DA、ACTH、CRH、CORT  酶聯**試劑盒購自美國 R&D 公司;DB001 Morris 水迷宮購自北京智鼠多寶生物科技有限責任公司; MK3 型酶標儀購自美國 Thermo;ET-12P 組織脫水機購自江西富華生物技術有限公司;RM223 切片機購自德國萊卡公司;DVP-W7 顯微鏡圖像處理系統購自南京民城信息系統公司。

1.4 分組與給藥

所有大鼠適應性喂養 3 d 后進行蔗糖水消耗測試, 選取蔗糖水攝入量相近的 72 只大鼠隨機分為 6 組, 包括正常對照組、抑郁模型組、氟西汀組

(5.4 mg/kg)、 復方柴金解郁片高、、 低劑量組(2.74、1.37、0.68 g/kg)。 造模同時灌胃給藥, 每日 1 次,連續 28 d,對照組、模型組則給予等體積的蒸餾水。 末次給藥結束后,所有大鼠進行行為學檢測,檢測完成后用水合氯醛將大鼠麻醉,腹主動脈取血,取大鼠下丘腦、垂體、腎上腺等組織固定于 10%甲醛溶液中,冷凍臺上取海馬組織,液氮速凍,保存待用。

1.5造模

     采用慢性不可預見性溫和應激聯合孤養建立抑郁大鼠模型[3],應激方法包括冰水浴 4 min、禁食或禁水 24 h、50 V 電擊 3 min、 傾籠 24 h、 噪音


4 h、光照或黑暗 24 h、潮濕墊料 24 h、夾尾 1 min, 每天采用 1~2 種刺激,同種刺激不連續出現,軀體應激每周限 1 次(電擊、夾尾), 28 d,

期間動物均孤籠飼養。

1.6行為學測試

1.6.1 糖水偏嗜度 給藥 28 d 后,禁食禁水 24 h, 測定每組動物 4 h 內的 1 %蔗糖水偏嗜度。 蔗糖偏嗜度=蔗糖水消耗量/( 蔗糖水消耗量+ 蒸餾水消耗量)×100%。

1.6.2 曠場實驗 將大鼠放入高 40 cm,長寬為 80 cm 的測試敞箱,以大鼠在 3 min 內穿越底面次數為水平得分(四爪均進入方格),以直立次數為豎直得分(兩前爪離開底面)。 記錄大鼠水平得分和豎直得分的總和。

1.6.3 Morris 水迷宮實驗 Morris 水迷宮操作系統:直徑為 1.5 m 的圓形水池,平臺直徑為 0.15 m, 水深 0.4 m,平臺置于迷宮西南象限。 水面高出平臺3 cm,水溫保持(24±1) ℃。 于第 23 天開始對各組大鼠進行水迷宮訓練,訓練 5 d,訓練完成后記錄大鼠爬上平臺的潛伏期時間, 考查大鼠的學習能力;于第 28 天撤去平臺,   記錄大鼠進入平臺所在象限的潛伏時間,考察大鼠的記憶能。

1.7 HE 染色
  
取固定于 4%甲醛溶液中的組織, 常規石蠟包埋,切片,薄片用二甲苯和各級乙醇切片脫蠟水洗, 洗完后用蘇木素染色 5 min,蒸餾水沖洗至干凈,經鹽酸乙醇分化和自來水浸泡后置伊紅液中 2 min, 純酒精脫水,二甲苯使之變透明,用加拿大樹膠封固,光學顯微鏡下觀察待檢測組織的病理情況。

1.8 ELISA 檢測
 
往預先包被待測抗體的微孔中,依次加入標本、標準品、HRP 標記的檢測抗體, 經過溫育并徹底洗滌。 用底物 TMB 顯色,TMB 在過氧化物酶的催化下轉化成藍色, 并在酸的作用下轉化成*終的黃色。顏色的深淺與各物質的含量呈正相關。 用酶標儀在450 nm 波長下測定光密度值。
1.9 統計學分析


采用 SPSS 17.0 統計軟件進行數據分析, 數據“x±s”表示, 采用 One-way-ANOVA 檢驗,P<0.05表示差異有統計學意義。

結果

2.1 對抑郁大鼠糖水偏嗜度的影響

給藥前(造模前),各組大鼠糖水偏嗜度無明顯差異(P>0.05)。 28 d 造模結束后,與對照組比較,模型組大鼠糖水偏嗜度明顯降低(P<0.01);與模型組比較,氟西汀組、復方柴金解郁片高、中劑量組大鼠糖水偏嗜度明顯升高(P<0.01 P<0.05),結果見表 1。


2.2 對抑郁大鼠活動次數的影響

     與對照組比較,抑郁模型組大鼠自主活動次數顯著下降(P<0.01)。 與模型組比較,氟西汀組和復方柴金解郁片高劑量組大鼠總活動數明顯增加 P<0.01);同時,中劑量的復方柴金解郁片也能使模型大鼠活動次數增加(P<0.05)。 結果見表 2。

2.3 對抑郁大鼠學習記憶能力的影響

與對照組比較,模型組大鼠出現學習記憶障礙, 表現為爬上平臺潛伏期時間和進入目標象限所耗時 間均明顯延長(P<0.01)。 在給予氟西汀和高劑量的復方柴金解郁片后, 大鼠學習和記憶能力均有所提升, 表現為找到平臺時間與進入目標象限時間均顯著降低(P<0.01  P<0.05)。 結果見表 2。



2.4 對抑郁大鼠血漿 ACTH、CRH、CORT 含量的影響與對照組比較,  模型組大鼠血漿 ACTH、CRH、CORT 均明顯升高(P<0.01)。   與模型組比較,氟西汀組、復方柴金解郁片高劑量組大鼠 ACTH、CRH、CORT 含量均明顯下降 (P<0.01 P<0.05);復方柴金解郁片中劑量組大鼠血漿 CORT 含量顯著下降 (P<0.05)。結果見表 3。


2.5 對抑郁大鼠海馬組織病理形態的影響

    如圖 1 所示,正常大鼠海馬椎體細胞排列整齊,形態規則,細胞間隙正常。 模型組大鼠海馬椎體細胞排列疏松,可見不同程度的胞體固縮,深染及空泡變性;給予氟西汀或高劑量復方柴金解郁片后,空泡細胞數量減少,細胞腫脹程度減輕,排列相對整齊; 而中、低劑量的復方柴金解郁片對海馬椎體細胞的保護作用較弱。

2.6  對抑郁大鼠海馬組織內單胺神經遞質的影響  與對照組比較,模型組大鼠海馬  5-HT、NA、DA含量均明顯降低  (P<0.01),5-HT 代謝產物 5-HIAA含量升高,兩者比值也顯著升高(P<0.01)。 與模型組比較,高劑量復方柴金解郁片組 5-HT、NA、DA 含量均明顯升高(P<0.05 或 P<0.01),5-HT 代謝率(5-HI- AA/5-HT)下降(P<0.01);中劑量復方柴金解郁片組5-HT 含量升高(P<0.05),5-HT 代謝率下降(P<0.05)。結果見表 4。













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